明治大学大学院農学研究科環境バイオテクノロジー研究室の伊東昇紀（博士後期課程1年）、小山内崇（准教授）らの研究グループは、物質生産に広く利用されているラン藻であるシネコシスティスの糖代謝経路の酵素が受ける一風変わった制御の機構と、その生理的意義を明らかにした。    シネコシスティスの糖代謝の中核を担う酸化的ペントースリン酸(OPP)経路を構成する酵素の働きが、温度やpH及び代謝産物などによって、どのように調節されているか、これまでほとんど分かっていなかった。    シネコシスティスのOPP経路の重要な酵素の性質を調べた結果、他の生物と異なり、シネコシスティスでは、クエン酸によって、OPP経路の酵素の働きが調節されていることが分かった。    『クエン酸』という糖代謝を制御する重要な因子の発見は、シネコシスティスの代謝のコントロールを容易にして、有用な物質を生産しやすくすると考えられる。    

 

要旨

持続可能な社会の実現に向けて、酸素発生型の光合成を行うラン藻を用いた二酸化炭素からの物質生産に関する研究が、世界中で行われています。ラン藻の中でも、シネコシスティス注1）という種は、物質生産に適した多くの利点を持つため、これまで広く利用されてきました。しかしながら、その生産量は、糖を炭素源とする大腸菌などと比べて低いため、実用化に向けて、改善の必要があります。

シネコシスティスは、糖代謝経路を経由して様々な有用物質を生産します。これまでの研究で、酸化的ペントースリン酸(OPP)経路が、シネコシスティスの糖代謝経路において、中心的な役割を担っていることが分かりました。OPP経路は、炭素の流れを決める還元力NADPHの生成を担います。しかしながら、シネコシスティスのOPP経路の生化学的な制御機構は、これまでほとんど分かっていません。このことが、生産性の向上を難しくしている原因の一つとなっています。そこで、私たちは、シネコシスティスのOPP経路の鍵酵素で、NADPHの生成反応を担うグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)と、いくつかの関連酵素の性質を詳細に調べました。

その結果、シネコシスティスのG6PDHは、他の生物のG6PDHと異なり、クエン酸回路のクエン酸で阻害されることが分かりました。同様に、OPP経路のNADPH生成反応を担うもう一つの酵素である6-ホスホグルコン酸脱水素酵素も、クエン酸で阻害されました。このクエン酸による阻害の生理的意義を調べるために、クエン酸回路のNAD(P)H生成反応を担う酵素の中で、唯一解析されていないコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素(SSADH)の性質を調べました。その結果、SSADHは、OPP経路の酵素同様、NADPHの生成反応を触媒しました。また、SSADHは、OPP経路の酵素と異なり、クエン酸によって阻害されませんでした。過去の他の酵素の解析結果も合わせると、シネコシスティスにおいて、OPP経路とクエン酸回路は、共にNADPHの生成経路であり、クエン酸による阻害は、OPP経路の酵素に特異的であることが分かりました。

以上から、シネコシスティスは、NADPHの過剰生産を避けるために、クエン酸回路を回すときは、クエン酸によってOPP経路の酵素の活性を抑えていると考えられます。

この研究は、明治大学大学院農学研究科 伊東 昇紀（博士後期課程1年）、小山内崇（准教授）のグループによって行われました。この研究は、ＪＳＴ戦略的創造研究推進事業先端的低炭素化技術開発ＡＬＣＡ（代表小山内崇）およびＪＳＰＳ科研費新学術領域研究「新光合成」（領域代表基礎生物学研究所皆川純教授、計画班代表大阪大学清水浩教授）の援助により行われました。

本研究成果は、2020年3月30日発行の英国科学誌「Biochemical Journal」オンライン版に掲載されました。

           

※研究グループ

明治大学　農学部農芸化学科　環境バイオテクノロジー研究室准教授　小山内　崇（おさない　たかし）、博士後期課程1年生　伊東　昇紀（いとう　しょうき）

１．背景　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　ラン藻は、植物と同じ酸素発生型の光合成を行う生物の中で、もっとも単純な生物です。地球上で初めて生成された光合成による酸素は、ラン藻によって供給されたものであると考えられています。地球温暖化や石油資源の枯渇が問題視されている近年では、このラン藻を用いて、空気中の二酸化炭素から有用な物質を作り出す「持続可能な物質生産」が注目されています。

ラン藻の中でも、シネコシスティスという種は、増殖が速く、取り扱いが容易であることから、物質生産に最適なラン藻として注目されています。これまでの研究で、シネコシスティスは、取り込んだ二酸化炭素から様々な有用物質を生産することが分かりました。さらに、多くの有用物質が、糖の分解を担う糖代謝経路から生成することも分かりました。しかしながら、その生産量は、糖を炭素源として利用する大腸菌などと比べると著しく低く、実用化にはまだ至っていません。大腸菌と異なり、シネコシスティスでは、糖代謝経路の制御機構がほとんど分かっておらず、培養条件の検討や代謝改変が難しいという問題を抱えています。

　酸化的ペントースリン酸(OPP)経路は、全てのラン藻で保存されている唯一の糖代謝経路で、炭素の流れを決める還元力NADPHの生成を担う経路です。グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)と6-ホスホグルコン酸脱水素酵素(6PGDH)という2つの酵素が、NADPHの生成反応を担います(図1)。特に、OPP経路の最初の反応を担うG6PDHは、OPP経路全体の反応速度を決定する最も重要な酵素です(図1)。これまでの研究で、シネコシスティスは、大腸菌よりもOPP経路の代謝産物が多いという炭素代謝の特徴を有していることが分かりました。また、シネコシスティスでは、OPP経路からのNADPHの生成が、光合成が十分に機能しない条件下で必要不可欠であることが分かりました。このように、シネコシスティスにおいて、OPP経路は、糖代謝経路の中核を担っています。しかしながら、シネコシスティスのOPP経路の制御機構は、いまだに謎に包まれています。

　そこで、私たちは、シネコシスティスのOPP経路の制御機構を明らかにするために、シネコシスティスのG6PDH(SyG6PDH)といくつかの関連酵素の機能を詳細に解析しました。

２．研究手法と成果　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

研究グループは、はじめに、SyG6PDHを大腸菌から精製し、様々な条件下で酵素活性を測定しました。その結果、SyG6PDHは、20-50℃、pH 7.0-10.5の範囲で、恒常的に高活性を示しました。また、SyG6PDHは、これまで他の生物のG6PDHの阻害剤として報告されてきたホスホエノールピルビン酸やNADPHによって阻害を受けました。さらに、SyG6PDHは、クエン酸回路の代謝産物であるオキサロ酢酸、クエン酸、2-オキソグルタル酸によって、顕著に阻害を受けました(図2)。このクエン酸回路の3つの代謝産物は、他の生物のG6PDHでは阻害剤として報告されておらず、SyG6PDH独自の阻害剤であることが判明しました。

次に、このクエン酸回路の3つの代謝産物のOPP経路への影響をさらに詳しく調べるために、3つの代謝産物存在下で、シネコシスティスの6PGDH(Sy6PGDH)の活性を測定しました。その結果、Sy6PGDHも、クエン酸回路の3つの代謝産物によって阻害を受けることが判明しました(図2)。中でも、Sy6PGDHは、クエン酸によって最も顕著に阻害されました(図2)。シネコシスティスの生体内では、クエン酸が、オキサロ酢酸と2-オキソグルタル酸よりも多く存在します。そのため、クエン酸によるOPP経路の酵素の阻害が、生体内では重要であると考えられます。

最後に、シネコシスティスのOPP経路とクエン酸回路の関係性を調べるために、還元力NAD(P)Hの生成反応を担うクエン酸回路の3つの酵素の中で、唯一性質が調べられていないコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素(SSADH)の性質を調べました。その結果、シネコシスティスのSSADH(SySSADH)は、同じクエン酸回路のイソクエン酸脱水素酵素(SyICD)同様、NADHではなく、NADPHの生成反応を触媒しました。このことから、シネコシスティスのクエン酸回路は、OPP経路同様、NADPHの生成経路であることが判明しました。また、SySSADHは、SyICD同様、クエン酸による阻害を受けませんでした(図3)。このことから、クエン酸による阻害は、OPP経路の2つの酵素に特異的であることが判明しました。

以上の結果から、「クエン酸が蓄積し、クエン酸回路が亢進するときは、同じNADPHの生成経路であるOPP経路の酵素が阻害される」という、NADPHの過剰生産を避けるためのシネコシスティス独自の糖代謝経路の制御モデルが浮き彫りになりました(図4)。

３．今後の期待　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　本研究グループは、世界で初めて、ラン藻のOPP経路とクエン酸回路の関係性を発見しました。この２つの大事な代謝が、クエン酸という１つの代謝産物で制御されていることがわかり、ラン藻は独自の代謝制御系を有することがわかりました。本研究成果は、これまで不明瞭であったラン藻の糖代謝経路の制御機構の理解に大きく貢献し、ラン藻を用いた物質生産を行い易くすると予想されます。今後も、ラン藻の糖代謝経路を構成する酵素の詳細な解析を進め、さらに知見を増やしていくことが、世界的に急務となっている持続可能な物質生産の実現につながると期待されます。

４．論文情報

＜タイトル＞

Unconventional biochemical regulation of the oxidative  pentose

phosphate pathway in the model cyanobacterium Synechocystis  sp. PCC 6803

（日本語タイトル　モデルラン藻Synechocystis  sp. PCC  6803の酸化的ペントースリン酸経路の型破りな生化学的制御） 

＜著者名＞

Shoki  Ito, Takashi Osanai

＜雑誌＞

Biochemical  Journal

＜DOI＞ https://doi.org/10.1042/BCJ20200038

 

 

５．補足説明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

注1）シネコシスティス

最も広く研究されている淡水性、単細胞性のラン藻。増殖が速く、直径が約1.5マイクロメートルの球形をしている。窒素固定を行わない。1996年に、ラン藻種の中で最初に全ゲノム配列が決定された。相同組換えによる遺伝子の改変が可能であり、凍結保存が可能であるなどの利点を有する。

 ■図について

図1. 酸化的ペントースリン酸(OPP)経路周辺の代謝地図

赤色の矢印が、OPP経路の反応を表しています。複数の反応からなる部分は、点線で表しています。OPP経路の最初と3番目の反応が、NADPHの生成反応で、それぞれグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)と6-ホスホグルコン酸脱水素酵素(6PGDH)が、担当します。

 

図2. 5  mM 代謝産物存在下のSyG6PDH(左)とSy6PGDH(右)活性

酵素活性は、代謝産物非存在下の活性を100％としたときの相対値で表しています。SyG6PDHとSy6PGDHは、クエン酸回路の代謝産物存在下で、活性が低下します。

図3. 5 mM クエン酸存在下のSySSADH活性

酵素活性は、クエン酸非存在下の活性を100％としたときの相対値で表しています。SySSADHは、クエン酸存在下で、活性が低下しません。

図4. クエン酸によるOPP経路酵素の阻害モデル

赤色の矢印がOPP経路の反応、青色の矢印がクエン酸回路の反応を表しています。